top of page

Ügyfelünk kutatása: bioprotekció Metschnikowia pulcherrima készítménnyel Kövérszőlő must esetében

Egyik nagyra becsült ügyfelünk, dr. Bene Zsuzsanna, a Tokajbor-Bene Pincészet vezetőjének publikációját osztjuk meg olvasóinkkal.


BENE ZSUZSANNA – VÁCZY KÁLMÁN ZOLTÁN


Eszterházy Károly Katolikus Egyetem, Eger


A szőlő- és bortermelési ágazatban is egyre inkább hangsúlyos szerepet kapnak a környezetvédelemi szempontok, a fenntarthatóság, élelmiszerbiztonság és egészségtudatosság, amelyek, mint fogyasztói igények és mint társadalmi elvárások is megjelennek. A fogyasztói elváros mellett az egészségtudatosság szempontjából is az egyik kiemelkedő szempont a csökkentett kénfelhasználás vagy a teljes kénmentesség a borokban.


Ennek a törekvésnek a megvalósításában tölthet be fontos szerepet az ún. bioprotekció, amelynek során olyan ún. bioprotekciós mikróba kultúra kerül alkalmazásra, amellyel megakadályozható az oxidáció, a káros mikroorganizmusok szaporodása gátolható és nagy mértékben csökkenthető vagy akár kiváltható a kénessav adagolás. Különös figyelmet igényel a nemesrothadásos alapanyagok mikrobiológiai védelme, mivel a Botyrtis cinerea jelenléte egyrészt alapvetően megváltoztatja a szőlőbogyó mikroflóra összetételét, másrészt a kénessavat megkötő ketosavak emelkedett mennyiségével együtt járó kémiai változásokat indukál.


Ennek megfelelően a kén-dioxid mérséklése vagy kiváltása bioprotekció alkalmazásával számos előnnyel járhat. Jelen tanulmányban az Erbslöh Oenoferm® MProtect Metschnikowia pulcherrima készítmény alkalmazásának tapasztalatait mutatja be nemesrothadásos bogyókat is tartalmazó Kövérszőlő alapanyag esetében.


Kulcsszavak: bioprotekció, csökkentett kénfelhasználás, Metschnikowia pulcherrima, nemesrothadás


BEVEZETÉS


Bioprotekció a borászatban


A bioprotekció (vagy biokonzerválás vagy biológiai kontroll) révén mikrooragnizmusok vagy azok antimikrobális hatású termékei kerülnek felhasználásra bioprotekciós hatóanyagként (GIANVITO et al., 2022).


A bioprotekciós stratégia élő mikroorganizmusok beoltásából (bioprotekciós kultúrák, BPC-k) vagy metabolitjaik (bioprotekciós metabolitok, BPM-k) hozzáadásából áll, tisztított formában, az élelmiszer előállítása során vagy azt követően. Ezek

a mikroorganizmusok különböző bioprotektív mechanizmusok révén akadályozzák meg az élelmiszer mikrobiális romlását, amelyek passzív (helyért, tápanyagért és oxigénért folytatott verseny) és aktív antagonista stratégiákra (antimikrobiális molekulák termelése) oszthatók.


A BPC-k hozzáadása az előállítási folyamat korai szakaszában képes kedvezően javítani az erjedés útján előállított élelmiszerek érzékszervi tulajdonságait, például az ízt, a textúrát és a tápértéket (GAGGIA et al., 2011).


A borászatban a kén-dioxid az egyik legfontosabb és leggyakrabban használt segédanyag antioxidáns és antimikrobiális tulajdonságainak köszönhetően. Számos jótékony hatása mellett jelölésköteles allergén és egyre több borfogyasztó érzékeny rá. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) alternatív módszereket szorgalmaz a bortermelésben történő felhasználásának csökkentésére vagy elhagyására (LISANTI et al., 2019). A lizozim, a DMDC, a kitozánok, nizin, allil izocianáttal átitatott paraffinlemezek alkalmazása mellett a bioprotekció fontos szerepet tölthet be ennek a törekvésnek a megvalósíthatóságában (GIACOSA et al., 2019). Leggyakrabban Torulaspora delbrueckii, Metschnikowia pulcerrima, Pichia kluyverii, vagy ezek kombinációja jelenik meg bioprotektív hatóanyagként (LEBLEUX et al., 2023).


A bioprotektív vadélesztő törzsek már a feldolgozás, vagy a hideg maceráció során adagolhatók, mely után 24-72 óra elteltével történhet a Saccharomyces fajélesztővel történő beoltás. A nem- Saccharomyces törzsek domináns jelenléte a prefermentatív fázisban megakadályozza az ecetsavbaktériumok szaporodását, gyéríti a penészgomba változatosságot és részt vesz a nemkívánatos oxidációs folyamatok megakadályozásában azáltal, hogy gyors oxigénfelhasználást végeznek, megkötik az oxidációt katalizáló fémeket (Cu²⁺, Fe²⁺). Csökken az acetoin képződés azáltal, hogy visszaszorulnak a Kloeckera apiculata és Candida stellata törzsek, amelyek nagy mennyiségben képesek acetoint termelni piroszőlősavból az acetolaktát szintézis révén.


Kevesebb nitrogéntápanyag felhasználás történik, több magasabb rendű alkohol, terpén-, észter- és tiolvegyület képződik, nő a glicerin tartalom, gazdagodik a savösszetétel (galakturonsav, tejsav, borostyánkősav) (VEJARANO, 2021).


A Metschnikowia pulcherrima törzs


A Metschnikowia pulcherrima vadélesztő a szőlőbogyó és a mustok elterjedt élesztőtörzse. Jellegzetessége, hogy antimikrobás vegyületként pulcherrimin vegyületet termel (1. ábra), amely egy oldhatatlan, nem-karotinoid, piros színű, gombaellenes pigment. A pulcherrimin prekurzor vegyülete a pulcherriminsav, amely a közegben lévő Fe-ionokkal reakcióba lép és megköti azokat, így azok a mikrooragnizmusok, amelyeknek életszükséglet a növekedéséhez a Fe ionok jelenléte, visszaszorulnak (ARNAOUTELI et al., 2019).


Számos élesztő- (Candida tropicalis, Candida albicans, Brettanomyces/Dekkera, Hanseniaspora és Pichia nemzetségek) és penészgomba (Botrytis cinerea, Penicillium, Alternaria és Monilia spp.) növekedését tudja hatékonyan gátolni (MORATA et al., 2019; SIPICZKI, 2006).



1. ábra: A pulcherrimin szintézis útvonala (Forrás: ARNAOUTELI et al., 2019)

A Metschnikowia pulcherrima (MP) számos enzimaktivitással rendelkezik: pektináz, proteáz, glükanáz, lichenáz, β-glükozidáz, celluláz, xilanáz, amiláz, szulfitreduktáz, lipáz és β-liáz, így egyike azon nem-Saccharomyces élesztőfajoknak, amelyek több extracelluláris hidrolitikus enzimet képesek termelni.α-arabinofuranozidáz és β-D-glükozidáz enzimének köszönhetően gyors aromafelszabadításra is képes segítve az illékony terpénvegyületek és tiolok képződését.


Az Erbslöh GmbH bioprotekció irányú fejlesztése az Oenoferm®MProtect készítmény, amely Metschnikowia pulcherrima nem-Saccharomyces törzset tartalmaz (2. ábra).



2. ábra: Oenoferm®MProtect


A nemesrothadás sajátos mikrobiotája és kémiai összetétele


A botrítiszes nemesrothadáson átesett szőlő mikroflórája nagymértékben eltér az egészséges szőlő felületén megtalálható mikroorganizmus - összetételtől. Az ép, egészséges szőlőbogyó összetételét a felületén található szaprofita élesztő-, és penészgombák, valamint baktériumok gyakorlatilag nem befolyásolják. A Botrytis cinerea azonban képes enzimesen fellazítani és elpusztítani az epidermisz-szövetet, így a bogyó héjja átjárhatóvá válik a felületi szaprobionta mikroflóra számára, különféle élesztőtörzsek (Candida, Rhodotorula, Pichia, Kluyveromyces fajok) (MAGYAR&BENE, 2006) és penészgombák (Aspergillus, Penicillium sp.) jelenlétével, valamint fokozott ecetsavbaktérium (Gluconobacter, Acetobacter) szaporodással lehet számolni.


A nemesrothadás jellegzetes kémiai változásokat idéz elő a must összetételében: nő a cukor- és glicerintartalom, megváltozik a savösszetétel, nő a mustokban a polifenoloxidázok mennyisége, amely a borok barnulásra és barnatörésre való hajlamát fokozza, felhalmozódnak a fenolsavak, jellegzetes ún. botrítiszes illat és zamatanyagok képződnek (gombaalkohol(1-okten-3-ol), szotolon nevű lakton (3-hidroxi-4,5-dimetil,2(5H)-furanon), nő a ketosavak mennyisége, megnő a biogén amin (tiramin, agmatin, fenil-etil-amin) és egyéb aminok (primer alifás aminok: i-butil-amin, 2-metil-butil-amin) koncentrációja (BENE, 2023).


ANYAG ÉS MÓDSZER


A kutatás alapanyagául Kövérszőlő szőlőfajta szolgált, amely a Tokaji borvidéken, a bodrogkeresztúri Lapis-dűlőben termett (3. ábra).



3. ábra: Egészséges és botrítizálódott bogyókat tartalmazó Kövérszőlő fürt A szüret


időpontja: 2023.10.14.

Cukortartalom: 360 g/l


Az alapanyag (A0) (10-10 kg): A1: 10 g/hl Oenoferm®MProtect-tel kezelt a bogyózást követően, valamint A2: 40 mg/l kén-dioxiddal kezelt tételekre lett osztva.Mindkét tétel 30 g/hl Oenoferm®Wild&Pure fajélesztővel került beoltásra a préselést követő 48 h elteltével, majd az erjedési stádium 10. napján került sor mintavételre.


A minták analitikai vizsgálata NMR- Nuclear Magnetic Resonance módszerrel történt (Diganosticum Zrt., Szerencs). H NMR technika (GODELMANN et al., 2013): H NMR spektrumok rögzítése 26,85°C-on Bruker AVANCE 400 spektrométerrel és 400’54 ASCEND magnet rendszerrel (Bruker, Karlsruhe, Germany) proton NMR módban, frekvencián of 400.13 MHz. A célzott vizsgálathoz való minta előkészítés és vizsgálati paraméterek a következők voltak: pH állítás pH 3,1-ra automata BTPH rendszerrel, deutérium és tetrametil- szilán adagolása, relaxációs késés 4 s, mintavételi idő 3,98 s, spektrális szélesség: 8223,68 Hz. Az adatok statisztikai elemzésére a STATA v17.0 szoftver szolgált.


Mindkettő minta esetében mikrobiológiai leoltás történt négyféle táptalajra a fajélesztős beoltást megelőzően.


  1. YGC (Yeast-Glucose-Chloramohenicol): glükóz 20g, élesztőkivonat 5g, agar 20g, kloramfenikol 100 mg/l, desztillált víz 1000 ml-ig

  2. MRS (Man-Rogosa-Sharpe): pepton 10g, élesztőkivonat 4g, húskivonat 8g, glükóz 20g, nátrium-acetát 2g, triammónium-citrát 5g, magnézium-szulfát 0,05g, mangán-szulfát 0,05g, aktidion 0,05g, paradicsomlé 250 ml, Tween-80 1ml, desztillált víz 1000 ml-ig

  3. MYP (Mannitol-Yeast-Peptone): mannitol 25g, élesztőkivonat 5g, pepton 3g, agar 12g, desztillált víz 1000 ml-ig

  4. GYP (Glucose-Yeast-Peptone): glükóz 30g, élesztőkivonat 5g, pepton 2g, agar 15g, desztillált víz 1000 ml-ig


Az YGC tápagar élesztő- és penészgomba-, az MRS tápagar a tejsavbaktériumok vizsgálatára szolgál, míg az MYP és GYP az ecetsavbaktériumokra. A vizsgálati musttételek 0,45 μm-es membránnal lettek szűrve, majd 26 oC-on, 3 napig történt az inkubálás.


EREDMÉNYEK


A bioprotekcióval és a kénezéssel kezelt must és törköly megjelenésében megmutatkozó különbséget a 4.ábra mutatja.




4. ábra: A különböző kezelések must és törköly mintái (baloldali a bioprotekcióval kezelt, a jobboldali a kénezett tétel)


Jól látható, hogy a bioprotekcióval történő kezelés hatására az enzimes barnulás mértéke lényegesen kisebb mértékű. A Botrytis cinerea lakkáz enzime a fenolos vegyületeket képes kinonokká oxidálni, emiatt a barnulás fokozottabb az aszúszemeket tartalmazó alapanyagok esetében, azonban az Oenoferm® Protecttel kezelt aszúsodott must és törköly világos színárnyalattal rendelkezik.


Az analitikai vizsgálatok során kapott eredmények a 5.,6.,7. ábrán láthatóak.



5. ábra: 10 nap elteltével a cukor- és a képződött glicerintartalom mennyisége (A0=az alapanyag feldolgozást követően; A1(MP)= a bioprotekcióval kezelt minta; A2=kén-

dioxiddal kezelt minta)


Ugyanannyi idő elteltével a bioprotekcióval kezelt tétel (A1(MP)) esetében nagyobb cukorfogyás volt megfigyelhető a kén-dioxiddal kezelt (A2) mintához képest és magasabb glicerinképződés volt mérhető. A statisztikai elemzés alapján szignifikánsnak mondható az eltérés a glicerintartalomban a kiindulási állapothoz képest (p=0.01).



6. ábra: A magasabb rendű alkoholok képződése az erjedési stádium 10. napján


Az érzékszervi tulajdonságokra kedvezően ható magasabb rendű alkoholok (2-fenil-etanol, 3- metil-butanol, 2,3-butándiol) mennyisége nagyobb a bioprotekcióval kezelt minta esetében. A 2-fenil-etanol, 3-metil-butanol és 2-metil-propanol esetében a statisztikai vizsgálat erősen szignifikáns eltérést mutat (p=0.004, p=0.003, p=0.0005), a 2,3-butándiol esetében szignifikáns (p=0.01) az eltérés mértéke a két kezelt minta között.



7. ábra: Etil-acetát, acetoin, ecetsav tartalom alakulása az erjedés 10. napján a kiindulási állapothoz képest (A0) a két kezelés esetében (A1(MP), A2)


Az ecetsav tartalom növekedésével mindig kell számolni botrítizálódott alapanyagok esetében, amely értékek egyrészt a nemesrothadásos bogyók felületének sajátos mikrobiológiai összetételéből adódik (az ecetsavbaktériumok fokozott jelenléte), másrészt az élesztők is termelik az ozmotikus stressz hatására. A bioprotekcióval kezelt tétel esetében is magas ez az érték, de nem annyira, mint a kén-dioxiddal kezelt minta esetében. A Metschnikowia pulcherrima sokkal jobban tűri a cukortartalom okozta nyomásviszonyokat, így nagy valószínűséggel ennek tudható be mind az acetoin, mind az etil-acetát tartalom esetében mérhető kisebb érték.


A tenyészthető mikroflóra összetételben bekövetkező változást a 8. ábra szemlélteti.



8. ábra: Az élősejtszám alakulása (CFU/ml) a fajélesztős beoltást megelőzően


Az élesztőgomba sejtszámban növekedés mutatható ki a fajélesztős beoltást megelőzően mindkettő kezelés esetében, a bioprotekcióval több nagyságrendnyire tehető a növekedés mértéke. A kénezés gyengíti és lassítja a vadélesztők növekedését, emiatt nem tudnak ugyanolyan gyorsan nőni és versengenek a tápanyagért, míg a Metschnikowia pulcherrima túlnövi a versenytársakat és nagyszámban szaporodni képes (9. 10. ábra).



9. ábra: Az YGC táptalajon a növekedés (baloldali a bioprotekcióval kezelt, jobboldali a kén-dioxiddal kezelt tétel)



10. ábra: Az YGC agaron növekvő Metschnikowia pulcherrima telepek mikroszkópos felvétele


Az ecetsavbaktériumok mindkettő kezelés során 10⁴ nagyságrendet értek el, ami magas érték. Felhívja a figyelmet, hogy egyik kezelés sem tudta aggálymentes szinten tartani az érzékszervi jellemzőkre gyakorolt negatív hatású baktériumtörzsek jelenlétét, ami az ecetsavtartalom termelésben is megmutatkozott.

A tejsavbaktériumok mennyiségében nincs nagyságrendbeli eltérés, kevesebb a bioprotekcióval kezelt minta esetében, de nem lényegesen.


KÖVETKEZTETÉSEK


Napjaink borkészítési filozófiájára nagymértékben meghatározó szereppel bírnak a fenntarthatósági szempontok és a klímaváltozás negatív hatásainak leküzdése. Általánosan tapasztalható, hogy a kedvező évjáratokban egyre magasabb a cukortartalmúak a mustok, ami az élesztők számára egyre nagyobb az ozmotikus stresszt jelent, miközben a baktériumok gyorsabban tudnak adaptálódni és felszaporodni.


A Metschnikowia pulcherrima élesztőtörzs jól tűri ezeket a körülményeket és ki tudja szorítani a nemkívánatos baktériumokat és az egyéb élesztőtörzseket, amelyek a tápanyagért folytatott versenyben így nem tudnak a Saccharomyces fajélesztők rovására teret hódítani. A kén-dioxiddal való kezelés elengedhetetlen segédanyag az aszúkészítés során a sajátos mikroflóra összetételében rejlő veszélyek miatt, de allergén hatása miatt mindenképpen szükséges csökkenteni a felhasznált mennyiségét.


A bioprotekció potenciális alternatíva lehet, de ahogyan az eredmények is mutatják, nem helyettesítheti teljes mértékben a kén-dioxidos kezelést. Amennyiben teljes mértékben elengedjük a kén-dioxid használatot és csak bioprotekcióval visszük végig az erjedési folyamatot, akkor is szembe kell néznünk emelkedett ecetsav, etil-acetát, acetoin vegyületekkel a folyamat végén és már nincs hatása a bioprotekciónak, technológiai szerepe nem hat a borkezelés és érlelés idejére. További vizsgálatra szorul, hogy ha a bioprotekciót kiegészítjük csökkentett mennyiségű kénfelhasználással, mennyire tudjuk befolyásolni ezen vegyületek képződését és az eltarthatóság időtartamára hogyan tud hatni.


Teljes kénmentességet nem tudunk megvalósítani a bioprotekcióval és az alkalmazhatóságát alapvetően meghatározza az évjárat, a termőhely és az alapanyag egészségi állapota, viszont egy olyan technológiai eszköz van a kezünkben, amellyel a fenntarthatóságot segíthetjük elő és a társadalmi igények fokozott kielégítését célozzuk meg.


KÖSZÖNETNYILVÁNITÁS


Ezúton szeretnénk megköszönni Hannes Weninger-nek és Reisner Tamásnak (Erbslöh Austria GmbH) a rengeteg szakmai segítséget, valamint a vizsgálathoz szükséges kezelőanyag biztosítását!


Felhasznált irodalom


AGARBATI, A., CANONICO, L., CIANI, M., COMITINI, F. (2023): Metschnikowia pulcherrima in Cold Clarification: Biocontrol Activity and Aroma Enhancement in Verdicchio Wine. Fermentation 9(3), 302; https://doi.org/10.3390/fermentation9030302

ARNAOUTELI, S., MATOZ-FERNANDEZ, D.A., PORTER, M., KALAMARA, M., ABBOTT, J., MACPHEE, C.E., DAVIDSON, F.A., STANLEY-WALL, N.R. (2019): Pulcherrimin formation controls growth arrest of the Bacillus subtilis biofilm biological sciences. Biological Sciences 116 (27) 13553-13562. https://doi.org/10.1073/pnas.1903982116

BENE ZS. (2023):Furmint in the process of botrytization. In: Bene, Zsuzsanna (szerk.) FURMINT SUMMIT - Absztraktkötet, Sárospatak, Magyarország: Tokaj-Hegyalja Egyetem (2023) 69 p. pp. 21-27.

GIANVITO, P., ENGLEZOS, V., RANTSIOU, K., COCOLIN, L. (2022): Bioprotection strategies in winemaking. International Journal of Food Microbiology. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2022.109532

GODELMANN, R., FANG, F., HUMPFER, E., SCHUTZ, B., BANSBACH, M., SCHAFER, H., SPRAUL, M. (2013): Targeted and Nontargeted Wine Analysis by H-1 NMR Spectroscopy Combined with Multivariate Statistical Analysis. Differentiation of Important Parameters: Grape Variety, Geographical Origin, Year of Vintage. Journal of Agricultural and Food Chemistry 61 (23) 5610-5619.

LEBLEUX, M., ALEXANDRE, H., ROMANET, R., BALLESTER, J., DAVID-VAIZANT, V., ADRIAN, M., TOURDOT- MARÉCHAL, R., ROUILLER-GALL, C. (2023): Must protection, sulfites versus bioprotection: A metabolomic study. Food Research International. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2023.113383

MAGYAR I., BENE ZS. (2006): Morphological and taxonomic study on mycobiota of noble rotted grapes in the Tokaj wine district. Acta alimentaria 35:2, pp.237-246.

VEJARANO, R., GIL-CALDERÓN, A. (2021): Commercially Available Non-Saccharomyces Yeasts for Winemaking: Current Market, Advantage over Saccharomyces, Biocompatibility and Safety. Fermentation , 7(3),v 171; https://doi.org/10.3390/fermentation7030171

GAGGIA, F., GIOIA, D.D., BAFFONI, L., BIAVITI, B. (2011):The role of protective and probiotic cultures in food and feed and their impact in food safety. Trends in Food Science & Technology 22

GIACOSA, S., SEGADE, R.S., CAGNASO, E., CAUDANA, A., ROLLE, L. (2019): SO2 in wines: rational use and possible alternatives. In book: Red Wine Technology.1:Ch21, Academic Press. https://doi.org/ 10.1016/B978-0- 12-814399-5.00021-9

LISANTI, M.T.; BLAIOTTA, G.; NIOI, C.; MOIO, L. (2019): Alternative methods to SO2 for microbiological stabilization of wine. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf.18, 455–479.

MORATA, A., LOIRA, I., ESCOTT, C., DEL FRESNO, J.M., BAÑUELOS, M.A., SUÁREZ-LEPE, J.A. (2019): Applications of Metschnikowia pulcherrima in Wine Biotechnology. Fermentation 5(3), 63; https://doi.org/10.3390/fermentation5030063

SIPICZKI M. (2006): Metschnikowia strains isolated from botrytized grapes antagonize fungal and bacterial growth by iron depletion. Appl. Environ. Microbiol. 72, 6716–6724.

Comentários


bottom of page